【基因檢測(cè)方法比較】基因檢測(cè)方法有哪些 基因檢測(cè)技術(shù)原理

1、第一代測(cè)序

1.1 Sanger測(cè)序采用的是直接測(cè)序法

1977年，Frederick Sanger等發(fā)明了雙脫氧鏈末端終止法，這一技術(shù)隨后成為最為常用的基因測(cè)序技術(shù)。2001年，Allan Maxam和Walter Gibert發(fā)明了Sanger測(cè)序法，并在此后的10年里成為基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。其基本原理即雙脫氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3'-OH，因此每當(dāng)DNA鏈加入分子ddNTP，延伸便終止。每一次DNA測(cè)序是由4個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)組成，將模板、引物和4種含有不同的放射性同位素標(biāo)記的核苷酸的ddNTP分別與DNA聚合酶混合形成長(zhǎng)短不一的片段，大量起始點(diǎn)相同、終止點(diǎn)不同的DNA片段存在于反應(yīng)體系中，具有單個(gè)堿基差別的DNA序列可以被聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離出來(lái)，得到放射性同位素自顯影條帶。依據(jù)電泳條帶讀取DNA雙鏈的堿基序列。

人類基因組的測(cè)序正是基于該技術(shù)完成的。Sanger測(cè)序這種直接測(cè)序方法具有高度的準(zhǔn)確性和簡(jiǎn)單、快捷等特點(diǎn)。目前，依然對(duì)于一些臨床上小樣本遺傳疾病基因的鑒定具有很高的實(shí)用價(jià)值。例如，臨床上采用Sanger直接測(cè)序FGFR 2基因證實(shí)單基因Apert綜合征和直接測(cè)序TCOF1基因可以檢出多達(dá)90%的與Treacher Collins綜合征相關(guān)的突變。值得注意的是，Sanger測(cè)序是針對(duì)已知致病基因的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR直接擴(kuò)增測(cè)序。單個(gè)突變點(diǎn)的擴(kuò)增包括該位點(diǎn)在內(nèi)的外顯子片段即可，不必將該點(diǎn)所在基因的全部外顯子都擴(kuò)增。

因此，應(yīng)明確定位要擴(kuò)增的位點(diǎn)所在的基因外顯子和該點(diǎn)的具體位置，設(shè)計(jì)包括該點(diǎn)在內(nèi)的上下游150~200 bp的外顯子片段引物。此外，盡管有NGS的出現(xiàn)，但Sanger測(cè)序?qū)τ谟兄虏』蛭稽c(diǎn)明確并且數(shù)量有限的單基因遺傳疾病的致病基因的檢測(cè)是非常經(jīng)濟(jì)和高效的。到目前為止，Sanger測(cè)序仍然是作為基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，也是NGS基因檢測(cè)后進(jìn)行家系內(nèi)和正常對(duì)照組驗(yàn)證的主要手段。

值得注意的是，Sanger測(cè)序目的是尋找與疾病有關(guān)的特定的基因突變。對(duì)于沒有明確候選基因或候選基因數(shù)量較多的大樣本病例篩查是難以完成的，此類測(cè)序研究還要依靠具有高通量測(cè)序能力的NGS。雖然Sanger測(cè)序具有高度的分析準(zhǔn)確性，但其準(zhǔn)確性還取決于測(cè)序儀器以及測(cè)序條件的設(shè)定。另外，Sanger測(cè)序不能檢測(cè)出大片段缺失或拷貝數(shù)變異等基因突變的類型，因此對(duì)于一些與此相關(guān)的遺傳性疾病還不能做出基因?qū)W診斷。

1.2連鎖分析采用的是間接測(cè)序法

在NGS出現(xiàn)之前，國(guó)際通用的疾病基因定位克隆策略是建立在大規(guī)模全基因掃描和連鎖分析基礎(chǔ)上的位置候選基因克隆。人類的染色體成對(duì)出現(xiàn)，一條來(lái)自父親，一條來(lái)自母親，每一對(duì)染色體在同樣的位置上擁有相同的基因，但是其序列并不完全相同，被稱為父系和母系等位基因。

遺傳標(biāo)記是指在人群中表現(xiàn)出多態(tài)現(xiàn)象的DNA序列，可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段或某個(gè)基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它存在于每一個(gè)人，但大小和序列有差別，具有可遺傳性和可識(shí)別性。目前采用第二代遺傳標(biāo)記，即重復(fù)序列多態(tài)性，特別是短串聯(lián)重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星標(biāo)記。

連鎖分析是以連鎖這種遺傳現(xiàn)象為基礎(chǔ)，研究致病基因與遺傳性標(biāo)記之間關(guān)系的方法。如果控制某一表型性狀的基因附近存在遺傳標(biāo)記，那么利用某個(gè)遺傳標(biāo)記與某個(gè)擬定位的基因之間是否存在連鎖關(guān)系，以及連鎖的緊密程度就能將該基因定位到染色體某一位置上。1986年Morton等提出優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)記分法(log odds score method，LOD)，主要檢測(cè)兩基因以某一重組率連鎖時(shí)的似然性。LOD值為正，支持連鎖；LOD值為負(fù)，則否定連鎖。通過計(jì)算家系中的微衛(wèi)星標(biāo)記與致病位點(diǎn)之間的LOD值，可以初步估算二者間的遺傳距離及連鎖程度，從而確定該基因在染色體上的粗略位置。然后利用該區(qū)域的染色體基因圖譜，分析定位區(qū)域內(nèi)所有基因的功能與表達(dá)，選擇合適的候選基因進(jìn)行突變檢測(cè)，最終將致病基因定位或克隆。

然而，采用連鎖分析進(jìn)行基因檢測(cè)存在很大的局限性。不但所需遺傳樣本量較大，一般要求提供三代及以上遺傳家系患者血樣，而且數(shù)據(jù)量大、處理復(fù)雜、產(chǎn)出速度較慢、定位不夠精確(一般只能定位在染色體某一區(qū)間)，這就使得研究工作繁重和定位基因的時(shí)間周期特別長(zhǎng)。目前，連鎖分析采用的單核苷酸多肽性和短串聯(lián)重復(fù)序列還在使用，但經(jīng)典的間接測(cè)序方法，如單鏈構(gòu)象多肽性、變性梯度凝膠電泳和異源雙鏈分析在美國(guó)已被淘汰，而在發(fā)展中國(guó)家作為研究手段還在有限使用。

2、新一代測(cè)序(NGS)

主要包括全基因組重測(cè)序(whole-genomesequencing，WGS)、全外顯子組測(cè)序(whole-exomesequencing，WES)和目標(biāo)區(qū)域測(cè)序(Targeted regionssequencing，TRS)，它們同屬于新一代測(cè)序技術(shù)。總體而言，NGS技術(shù)具有通量大、時(shí)間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)，使得遺傳學(xué)者可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)感興趣的基因進(jìn)行精確定位。但這些不同的測(cè)序技術(shù)在測(cè)序范圍、數(shù)據(jù)分析量以及測(cè)序費(fèi)用和時(shí)間等方面又有很大差別，如果選擇適合的方法，對(duì)于臨床診斷和科學(xué)研究將起到事半功倍的作用。

2.1目標(biāo)區(qū)域測(cè)序目前常用的是基因芯片技術(shù)

其測(cè)序原理是基于DNA雜交原理，利用目標(biāo)基因組區(qū)域定制的探針與基因組DNA進(jìn)行芯片雜交或溶液雜交，將目標(biāo)基因區(qū)域DNA富集，再通過NGS技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。其測(cè)序過程是通過把數(shù)以萬(wàn)計(jì)的cDNA或寡聚核苷酸置于芯片上制成列陣，將芯片上固定好的已知序列的核苷酸探針與溶液中含有熒光標(biāo)記的相應(yīng)核酸序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，根據(jù)測(cè)序儀所顯示強(qiáng)熒光的位置和強(qiáng)度，獲取每組點(diǎn)陣列信息，再利用生物信息學(xué)算法確定目的靶核苷酸的序列組成。測(cè)序所選定的目標(biāo)區(qū)域可以是連續(xù)的DNA序列，也可以是分布在同一個(gè)染色體不同區(qū)域或不同染色體上的片段。目標(biāo)區(qū)域測(cè)序技術(shù)，對(duì)于以往通過連鎖分析將基因突變鎖定在染色體某一片段區(qū)域內(nèi)，但無(wú)法找出突變是一個(gè)非常好的進(jìn)一步檢測(cè)手段。2010年，Nicholas等使用基因分型芯片聯(lián)合連鎖分析技術(shù)，成功發(fā)現(xiàn)頭小畸形的新基因WDR62，文章發(fā)表在《NatGenet》雜志。類似的研究在家族性胰腺癌中確定8個(gè)候選變異位點(diǎn)和在家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變發(fā)現(xiàn)易感基因TSPAN12。

基因芯片測(cè)序技術(shù)可以將經(jīng)過連鎖分析鎖定了目標(biāo)范圍或經(jīng)過全基因組篩選的特定基因或區(qū)域進(jìn)行更深一層的研究，是解決連鎖分析無(wú)法發(fā)現(xiàn)致病基因的有效手段。基因芯片技術(shù)對(duì)于已知基因突變的篩查具有明顯優(yōu)勢(shì)，可以快速、全面地檢測(cè)出目標(biāo)基因突變。同時(shí)，由于目標(biāo)區(qū)域受到了限制，測(cè)序范圍大幅度減少，測(cè)序時(shí)間和費(fèi)用相應(yīng)降低。但基因芯片檢測(cè)所需要的DNA的量要大，由于已提取的DNA存在降解的風(fēng)險(xiǎn)，用于基因芯片研究的血標(biāo)本最好是冰凍的全血，這樣可以使用于檢測(cè)DNA的量有充分保證。

2.2全外顯子組測(cè)序(WES)

外顯子組是單個(gè)個(gè)體的基因組DNA上所有蛋白質(zhì)編碼序列的總合。人類外顯子組序列約占人類全部基因組序列的1%，但大約包含85%的致病突變。WES是利用序列捕獲技術(shù)將全外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因分析方法。采用的技術(shù)平臺(tái)主要是羅氏公司的SeqCap EZ全外顯子捕獲系統(tǒng)，Illumina公司的Solexa技術(shù)和Agilent公司的SureSelect外顯子靶向序列富集系統(tǒng)。其捕獲的目標(biāo)區(qū)在34~62 M之間，不僅包括編碼區(qū)同時(shí)也加入了部分非編碼區(qū)。NGS的測(cè)序過程主要包括DNA測(cè)序文庫(kù)的制備、錨定橋接、PCR擴(kuò)增、單堿基延伸測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。研究者根據(jù)測(cè)序儀捕獲到在測(cè)序過程中摻入有不同熒光標(biāo)記堿基片段，經(jīng)計(jì)算機(jī)將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化成不同顏色的測(cè)序峰圖和堿基序列?；驕y(cè)序結(jié)果與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)等國(guó)際權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，最終確定是否為突變基因。

自NGS技術(shù)問世以來(lái)，利用WES在臨床疾病致病基因的鑒定研究中取得前所未有的成果。這些成果不僅集中在單基因遺傳疾病，還在多基因影響的復(fù)雜疾病中獲得大量相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)。在單基因遺傳性疾病中，如視網(wǎng)膜色素變性、終端骨發(fā)育不良等發(fā)現(xiàn)新基因或已知基因新突變。在一些罕見的疾病中，如Kabuki綜合征、家族性混合型低脂血癥和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)癥等疾病中發(fā)現(xiàn)新的致病基因。同時(shí)，在小細(xì)胞肺癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病等腫瘤研究和諸如肥胖癥、腦皮質(zhì)發(fā)育不良等復(fù)雜疾病的研究中也取得豐碩成果。

WES技術(shù)在篩查范圍和檢出率等方面較其他測(cè)序技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。例如，對(duì)于采用Sanger測(cè)序和基因芯片測(cè)序不能篩查出基因的樣本，可以采用WES來(lái)進(jìn)一步基因篩查鑒定。應(yīng)用WES技術(shù)能夠獲得較傳統(tǒng)Sanger等方法對(duì)編碼區(qū)測(cè)序更深的覆蓋度和更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。由于信息量的大幅度增加，WES可以獲得更多個(gè)體的編碼區(qū)信息，因此成為檢測(cè)致病基因和易感基因位點(diǎn)的有效手段。與連鎖分析定位方法比較，WES對(duì)家系的要求并不十分嚴(yán)格，在單基因遺傳病同一家系中有2~3個(gè)患者和1個(gè)正常人即可進(jìn)行致病基因的鑒定研究，而不需要連續(xù)三代的遺傳家系。由于不需要嚴(yán)格的三代以上的遺傳家系，WES使以前不能進(jìn)行研究的家系成為可能。不僅對(duì)于單基因遺傳病是一個(gè)很好的研究手段，對(duì)于許多常見病，如腫瘤、糖尿病等疾病也可進(jìn)行大規(guī)模比較研究。

2.3全基因組重測(cè)序(WGS)

WGS是對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的全基因組的測(cè)序，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析后對(duì)序列進(jìn)行拼接、組裝并獲得基因組圖譜，或是對(duì)不同組織進(jìn)行測(cè)序并分析體細(xì)胞突變的一種研究方法。盡管WES可以快速全面地找出個(gè)體基因組上的所有突變，從而找到個(gè)體間的差異，但對(duì)于外顯子以外的區(qū)域則不能有效地進(jìn)行基因檢測(cè)。對(duì)于此種情況，目前還要借助WGS進(jìn)行全基因組檢測(cè)。但由于人類基因組過于龐大，一次單端全基因組測(cè)序很難達(dá)到所需要的測(cè)序深度。因此，需要重復(fù)測(cè)序或雙端測(cè)序，由此帶來(lái)測(cè)序成本的大幅度提高和由于不能達(dá)到足夠的測(cè)序深度所導(dǎo)致的結(jié)果準(zhǔn)確性的降低。而對(duì)于臨床疾病診斷和普通科研工作，其高昂的檢測(cè)費(fèi)用也是難以承受的。盡管如此，對(duì)于部分臨床研究和WES不能解決的科研課題還需要借助WGS進(jìn)行更加全面的基因檢測(cè)。

3、展望

NGS的出現(xiàn)為新興的基因組技術(shù)增添了無(wú)限的活力和想象空間。特別是基因芯片的問世和已在臨床上應(yīng)用于大樣本的疾病篩查和基因診斷中所展現(xiàn)出的活力，以及其商業(yè)化發(fā)展的模式都令人鼓舞。在眼科是單基因病最常見的學(xué)科，利用芯片技術(shù)進(jìn)行Laber病的篩查已使很多病因不清楚的視神經(jīng)萎縮得到明確診斷。而原發(fā)性開角型青光眼是眼科最具隱蔽性和危險(xiǎn)性的致盲性眼病，其致病基因或突變的鑒定研究對(duì)疾病篩查將有著非常重要的臨床價(jià)值和巨大的商業(yè)價(jià)值。在新生兒糖尿病的篩查中采用基因芯片技術(shù)可以更加快速、全面經(jīng)濟(jì)，避免第一代測(cè)序過于繁瑣和漏檢。

基因芯片技術(shù)在產(chǎn)前診斷中更加具有發(fā)展前景。只要對(duì)孕婦進(jìn)行DNA血液檢查即可進(jìn)行遺傳疾病的篩查，避免以往通過羊膜穿刺抽取羊水進(jìn)行有創(chuàng)檢查的局限性和危險(xiǎn)性。目前，基因檢測(cè)技術(shù)水平的提升和檢測(cè)費(fèi)用的不斷降低，發(fā)展大規(guī)模個(gè)體化基因檢測(cè)在不久的將來(lái)成為可能。同時(shí)，藥物易感性基因和疾病發(fā)生的易感基因的檢測(cè)的深入開展，個(gè)體化醫(yī)療將在基因檢測(cè)的基礎(chǔ)上得以實(shí)現(xiàn)。有理由相信，隨著人們生活水平的不斷提高和健康意識(shí)不斷增強(qiáng)，基因檢測(cè)在未來(lái)醫(yī)學(xué)發(fā)展中應(yīng)用前景將十分可觀。